เวลาสองปีผ่านไปนับแต่ที่ ปีเตอร์ ปาร์กเกอร์ (โทบี้ แม็กไกวร์) หนุ่มนิสัยอ่อนโยนได้เดินไปจาก แมรี่ เจน วัตสัน (เคิร์สเตน ดันสต์) หญิงสาวที่เขาหลงรักมาเป็นเวลานาน และตัดสินใจที่จะเดินไปบนเส้นทาง เพื่อทำหน้าที่รับผิดชอบต่อเพื่อนมนุษย์ ในฐานะของ สไปเดอร์แมน ปีเตอร์ต้องเผชิญหน้ากับความท้าทายใหม่ เมื่อเขาต้องดิ้นรนเพื่อรับมือกับ ‘ของขวัญและคำสาป’ จากพลังของเขา ในขณะที่ต้องรักษาสมดุลย์ของสองตัวตน ทั้งในฐานะซูเปอร์ฮีโร่ ที่ไวเป็นปรอทอย่างสไปเดอร์แมน และการใช้ชีวิตในฐานะนักศึกษามหาวิทยาลัย ความสัมพันธ์ที่ปีเตอร์รักที่สุด กลับต้องตกอยู่ในอันตราย อันเนื่องมาจากการเปิดเผยตัว เมื่อเขาต้องเผชิญหน้ากับวายร้ายหนวดยุ่บยั่บ ที่มีพลังมหาศาลอย่าง ด็อกเตอร์อ็อคโตปุส หรือผู้มีฉายาว่า ด็อค อ๊อคก์ (อัลเฟร็ด โมลีน่า)